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La estimación de la diversidad es un factor determinante para conservar y aprovechar los recursos genéticos presentes en el medio ambiente. Con el fin de contribuir al conocimiento de la diversidad genética de los hongos controladores biológicos de insectos de la zona central cafetera colombiana, mediante técnicas moleculares se estudiaron las poblaciones del hongo Metarhizium spp. La evaluación de la diversidad genética se realizó mediante la secuenciación de las regiones espaciadoras transcritas de los genes ribosomales (ITS) y de los exones de la región 3 del gen de la beta-tubulina, y por medio de la amplificación de fragmentos polimórficos en sus sitios de restricción (AFLPs). Se evaluaron 33 aislamientos recolectados en la zona cafetera. Las diferencias entre los organismos se analizaron mediante la construcción de matrices de similitud a partir de 203 marcadores AFLPs, utilizando el índice de Jaccard. Los aislamientos se agruparon mediante el algoritmo UPGMA y el análisis de coordenadas principales PCOORDA. Las secuencias de regiones ITSs y beta-tubulina de aislamientos representativos de los grupos obtenidos, se compararon con secuencias existentes en GenBank y se analizaron mediante alineamiento múltiple usando CLUSTAL. Se ratificó la existencia de tres grupos intra-específicos para Metarhizium anisopliae, que no tienen relación con origen geográfico, tipo de cultivo, ni hospedero. El análisis de DNA ribosomal ubica a todos los aislamientos obtenidos dentro de la subespecie M. anisopliae anisopliae, con estado perfecto en Ascomycetes Clavicipetales. Metarhizium presentó dos genes de beta-tubulina, que pueden corresponder a dos alelos o a una familia, pero con significancia taxonómica.