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La llaga radical causada por el hongo del suelo Rosellinia spp. es una enfermedad terminal en café (Coffeaspp.), debido a que las plantas no se recuperan luego de la infección y el área de los focos no tratados aumenta con el tiempo. Se recomienda un manejo integrado para enfrentar los problemas causados por estos patógenos en las zonas cafeteras colombianas, dada la dificultad de controlar los brotes que aparecen en los lotes. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos específicos y sensibles, basados en PCR, para detectar niveles de inóculo remanentes, con el propósito de verificar la idoneidad del suelo para nuevas plantaciones o de comprobar la recuperación de sitios previamente afectados con el fin de replantar. Parejas de iniciadores para PCR cuantitativo (qPCR) se diseñaron con base en secuencias obtenidas a priori, de marcadores AFLP polimórficos. Se validaron por PCR convencional y PCR en tiempo real, cuatro combinaciones de iniciadores que permitieron la discriminación individual y simultánea entre las especies R. pepo y R. bunodes. Éste es el primer reporte de un diagnóstico con herramienta de PCR para identificar especies de Rosellinia asociadas a café en Colombia, y es el paso inicial para el desarrollo de herramientas de diagnóstico de inóculo en suelo en el manejo de la enfermedad.